熒光定量PCR早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理： 隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測 產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。
一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋， 無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。
羅氏480定量PCR儀代理下面做簡單介紹：
1、熒光域值（threshold）
是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺省設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold。
2、Ct 值：是指每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
3、Ct值與起始模板的關(guān)系：
研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐 標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值如下圖所示。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
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